隨著“后基因組時(shí)代”的到來(lái),蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能研究已成為目前生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿,在蛋白質(zhì)科學(xué)研究中意義重大。獲取蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息的主要手段是X射線衍射技術(shù),然而蛋白質(zhì)結(jié)晶一直是該技術(shù)的瓶頸問(wèn)題。因此,蛋白質(zhì)結(jié)晶是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,開(kāi)展蛋白質(zhì)結(jié)晶研究對(duì)于制備高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體,進(jìn)而保證高精細(xì)結(jié)構(gòu)信息的獲取,具有十分重大的意義。

蛋白質(zhì)晶體在物化性質(zhì)上有很多的特殊性。首先,它們尺寸較大、密度較低、極度柔軟、雜質(zhì)水平較高;其次,對(duì)過(guò)飽和度、溫度、pH值、析出劑濃度、壓力等環(huán)境因素十分敏感;再次,蛋白質(zhì)晶體需要維持完全水合狀態(tài),因此,晶體只能在其母液中研究。這些是一些高分辨率觀察研究手段如電子顯微鏡難以克服的障礙。

而20世紀(jì)80年代誕生的原子力顯微鏡技術(shù),則完全可以解決上述問(wèn)題,因此成為可以在納米到微米尺度范圍內(nèi)直接觀察蛋白質(zhì)晶體的有力手段。更為重要的是,在原子力顯微鏡掃描過(guò)程中,針尖的移動(dòng)對(duì)被研究樣品影響甚微,因此它是一種近似的非侵入式研究手段。由于該特點(diǎn),它除了觀察形貌外,還可以研究各種正在發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程,通過(guò)研究這些動(dòng)態(tài)過(guò)程中的變化,并與相關(guān)的動(dòng)力學(xué)條件聯(lián)系,即可研究動(dòng)力學(xué)過(guò)程的機(jī)理。這種能力為研究蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程提供了前所未有的理想條件。利用該技術(shù),甚至可以觀察到蛋白質(zhì)分子如何進(jìn)入到晶體狀態(tài)的過(guò)程?？梢?jiàn),它對(duì)于了解和研究蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)過(guò)程具有重要意義。20世紀(jì)90年代初Durbin等首次將原子力顯微鏡應(yīng)用到蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)研究,此后,人們?cè)谶@個(gè)領(lǐng)域開(kāi)展了大量的研究工作。通過(guò)原子力顯微鏡,不僅實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)晶體從單個(gè)分子到小晶體尺度范圍內(nèi)的可視化,還觀察到了蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的各種生長(zhǎng)機(jī)制,并研究了晶體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,揭示了蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)與小分子晶體生長(zhǎng)的相同之處,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些與小分子晶體生長(zhǎng)不同之處。此外,還開(kāi)展了對(duì)蛋白質(zhì)晶體缺陷的研究。由于蛋白質(zhì)晶體的缺陷是導(dǎo)致X射線衍射分辨率低下的關(guān)鍵因素,因此該工作具有十分重要的意義。本文對(duì)近年來(lái)原子力顯微鏡研究蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)述,并對(duì)其未來(lái)將在蛋白質(zhì)晶體學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更加重要作用做了預(yù)期。

研究形核的目的,一是讓不易結(jié)晶的生物大分子形核;二是盡量減少易結(jié)晶的生物大分子形核的數(shù)量。這不僅可以滿足X射線衍射的要求,而且有重要的實(shí)際意義,例如等尺寸形核的晶體作為藥物時(shí),可穩(wěn)定等速度釋放藥效。形核過(guò)程作為蛋白質(zhì)結(jié)晶的第一個(gè)過(guò)程,由于其自發(fā)性和在時(shí)間和空間上的不可預(yù)見(jiàn)性,所以迄今為止研究還相對(duì)較少。

蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的母液復(fù)雜而且易變,其中除了大多數(shù)小而穩(wěn)定的聚集物,還有較大的亞穩(wěn)液相聚集物。而后者有快速形成多層聚集物或微晶的潛能,而且會(huì)對(duì)生長(zhǎng)晶體長(zhǎng)序結(jié)構(gòu)有所貢獻(xiàn)。利用原子力顯微鏡AFM,在晶體表面已觀察到上述亞穩(wěn)液相聚集物的存在。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先在襯底附著少量的含有蛋白質(zhì)晶體的溶液,然后放入AFM液體池內(nèi),加入大量的蛋白質(zhì)過(guò)飽和溶液。在最初階段,AFM觀察到了晶體表面聚集體的沉降。Kuznetsov等認(rèn)為沉降前的液相聚集物可能有兩種趨勢(shì),一是形成規(guī)則的晶體,其發(fā)展取決于底層晶胞。二是形成不同于底層晶胞的微晶,并最終與底層晶體合并。從晶體分離的部分蛋白質(zhì)分子可能沒(méi)有溶解到溶液中,而是形成了可在晶體表面結(jié)晶的亞穩(wěn)態(tài)液相聚集物。

盡管蛋白質(zhì)晶體在溶液中的形核是不可預(yù)見(jiàn)的,然而在襯底上的異質(zhì)形核還是有一定的可控性。Rong等利用原子力顯微鏡在涂有聚賴氨酸的玻璃底層上成功控制了溶菌酶晶體的形核方向。Kubo等利用AFM發(fā)現(xiàn)了溶菌酶晶體低溫相(110)面傾向平行于厚的脂肪酸薄膜和空白的云母片底層,并發(fā)現(xiàn)其取向形核程度不但隨醋酸鈉濃度的增加而增加,而且顯著地受pH值和過(guò)飽和度的影響。