單個(gè)生物大分子力學(xué)性質(zhì)已經(jīng)成為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域,近幾年來由于單分子技術(shù)的不斷發(fā)展,這個(gè)領(lǐng)域取得了很多突破性的進(jìn)展。本文介紹了基于原子力顯微鏡技術(shù)的幾種單分子壓彈性測(cè)量技術(shù)及這些技術(shù)的具體應(yīng)用,同時(shí)也簡(jiǎn)要闡述了這些技術(shù)的局限性。另外對(duì)這個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展也進(jìn)行了初步地探討?！?/span>

隨著納米測(cè)量技術(shù)的發(fā)展(如納米磁珠、光鑷子、原子力顯微鏡等),尤其是皮牛pN(10-12牛頓)測(cè)量技術(shù)的出現(xiàn)使人們能夠研究單個(gè)生物大分子(DNA和蛋白質(zhì)分子)的動(dòng)力學(xué)行為,且能對(duì)其進(jìn)行直接操縱,從而在單分子水平上對(duì)DNA和蛋白質(zhì)的力學(xué)性質(zhì)(彈性或柔性)進(jìn)行研究。近年來單個(gè)生物分子力學(xué)性質(zhì)的研究引起了人們很大的興趣。這是因?yàn)閺奈锢韺W(xué)角度看,單個(gè)分子的彈性是否與宏觀物體的彈性相同是一個(gè)值得探討的問題;從生物學(xué)角度看,生物大分子一般都具有一定的柔性,即在微小的外力作用下會(huì)發(fā)生構(gòu)像的改變,從而導(dǎo)致其功能的變化,單分子彈性的研究將有助于揭示其結(jié)構(gòu)與功能之間的動(dòng)力學(xué)規(guī)律,探索潛在的生物學(xué)特別是遺傳學(xué)的意義;此外,生物大分子是一類頗受重視的天然納米材料,從材料科學(xué)角度看,單分子力學(xué)性質(zhì)的研究對(duì)于納米器件的組裝和連接也十分重要,它將直接影響納米器件最終的工作性能。

目前,在利用原子力顯微鏡技術(shù)研究單個(gè)生物大分子力學(xué)性質(zhì)方面,大量研究工作主要集中在單分子的拉伸特性上,通常采用的方法是將一個(gè)大分子的一端固定在修飾過的襯底表面,用原子力顯微鏡的針尖拉伸另一端,有關(guān)單分子拉伸特性已經(jīng)報(bào)道了大量令人興奮的研究成果,同時(shí)也有很多優(yōu)秀的評(píng)述文章,其中最有代表意義的是對(duì)單個(gè)DNA分子的拉彈性的研究(stretchingelasticity)。最近有不少研究組開始探索單個(gè)分子的壓縮特性,他們通常采用的方法是用原子力顯微鏡的針尖去壓分散在襯底表面的單個(gè)分子。在本文中,我們首先評(píng)述基于原子力顯微鏡技術(shù)的幾種單分子壓彈性測(cè)量方法及其具體應(yīng)用,然后簡(jiǎn)要闡述這些方法在研究單個(gè)DNA分子壓彈性時(shí)的局限性。

原子力顯微鏡在接觸模式下針尖與樣品的作用力可以很精確地控制,通常采用接觸模式的力曲線(force2distancecurve)可以較好地測(cè)量柔軟樣品的壓彈性。首先在硬樣品(如玻璃或云母)的表面做一條力曲線(區(qū)域2),然后將要研究的單分子樣品取代硬樣品重新做力曲線(區(qū)域3),此時(shí)不能改變?nèi)魏螌?shí)驗(yàn)條件。針尖與樣品間相互作用力F可根據(jù)胡克定律算出:F=k×d,其中k,d分別是懸臂彈性系數(shù)及懸臂的偏折量(軟樣品表面的凹陷量可由在軟的和硬的樣品表面獲得的力曲線相減得到)。根據(jù)所用針尖的不同,可用Hertz公式計(jì)算出樣品的彈性模量:d3=9(1-μtip)2F2P(16RE)其中μtip,R,E分別是樣品的泊松系數(shù)(一般軟樣品取1P3),針尖半徑及樣品的彈性模量。

利用接觸模式下的力曲線在單分子力學(xué)性質(zhì)的研究中已經(jīng)做了大量的工作,得到了在納米尺度下許多與宏觀狀態(tài)下不同的特性。在早期的生物分子研究中,實(shí)驗(yàn)大多是在液體下進(jìn)行的,這樣比較接近生物分子的生理狀態(tài)。Radmacher等人研究了液體下分散在云母表面的單個(gè)溶菌酶分子的壓彈性,用赫茲模型計(jì)算到它的彈性模量是015±012GPa,這個(gè)結(jié)果與其宏觀晶體的壓縮率較接近(012～1GPa),同時(shí)在做力曲線時(shí)他們比較了在云母上與溶菌酶蛋白分子上針尖的Liftoff值,得到蛋白分子的粘度(viscosity)為800±400pN。魏青青等人也用力曲線的方法研究了不同功能狀態(tài)的兔骨骼肌ryanodine受體P鈣釋放通道(RyR1)的彈性。首先對(duì)處于抑制狀態(tài)的RyR1進(jìn)行測(cè)量,接著用5mmolPL的AMP和50μmolPL的Ca2+將其激活,發(fā)現(xiàn)它的彈性模量有較明顯的升高,然后將緩沖液換為無AMP和Ca2+的抑制性溶液后,發(fā)現(xiàn)其彈性模量又有較明顯的下降。但采用其他抑制劑(如釕紅)和激動(dòng)劑(咖啡因)時(shí),RyR1的彈性沒有明顯的變化。另外他們也注意到每次實(shí)驗(yàn)測(cè)量得到RyR1的彈性模量的誤差很大,這可能是由于在液態(tài)下針尖與樣品的作用力要比大氣中復(fù)雜而且熱漂移較大引起的。近來許多研究組也經(jīng)常在大氣中測(cè)量單分子的壓彈性。Zhao等人用導(dǎo)電原子力顯微鏡在空氣中測(cè)量了單個(gè)azuin蛋白分子的彈性[20],計(jì)算得到彈性模量為14GPa。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其應(yīng)變-應(yīng)力曲線幾乎是線性的而且通過原點(diǎn),說明這是一種彈性形變。另外Tsukruk等人也在大氣環(huán)境中比較了單個(gè)分枝分子(singledendriticmolecules)與其聚合體的彈性差異[21,22],發(fā)現(xiàn)聚合體的彈性(250±30MPa)要明顯大于單體的彈性(150±25MPa),他們認(rèn)為這可能是由于聚合體形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其變得較硬。

單個(gè)生物大分子力學(xué)性質(zhì)的研究是一個(gè)很重要的問題,因?yàn)樗c諸多的生物學(xué)過程密切相關(guān)。近年來由于單分子技術(shù)的不斷發(fā)展,這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)取得了許多突破性的進(jìn)展,單分子力學(xué)已成為生物物理的一個(gè)熱點(diǎn)問題。但同時(shí)我們也看到還有許多問題沒有得到解決。譬如,作為一個(gè)細(xì)長(zhǎng)的柔軟分子,DNA的彈性主要由三個(gè)基本彈性組成:縱向(沿雙螺旋方向)拉伸彈性、橫向(沿直徑方向)壓縮彈性以及扭轉(zhuǎn)彈性。盡管人們?cè)趩畏肿訅簭椥匝芯糠矫嬉呀?jīng)做了很多努力,取得了大量的研究成果,但據(jù)我們所知,作為單分子壓彈性研究的試金石,單個(gè)DNA分子壓彈性的數(shù)據(jù)至今還沒有得出。這是因?yàn)镈NA分子的直徑只有約2nm,為了在小力區(qū)(F<015nN)精確測(cè)量其壓彈性,在其上施加的作用力與相應(yīng)的形變測(cè)量的精度必須分別達(dá)到～011nN和～011nm,這對(duì)目前的原子力顯微技術(shù)是很大的挑戰(zhàn):
(1)采用接觸模式下的力曲線方法,如果在液體下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),針尖要受到很大的粘滯力,而且液體下的熱漂移很嚴(yán)重;如果在空氣中測(cè)量,由于Jump2into2contact(～110nm)現(xiàn)象的存在,盡管人們已經(jīng)用了很多精力包括利用針尖修飾等各種途徑去盡量減小這個(gè)值,可至今還沒有完全克服,因此很難精確測(cè)量DNA分子的初始形變。
(2)利用TM2AFM下的力曲線,在液體下針尖與樣品的作用力很復(fù)雜,不能判別是否為斥力相互作用;而在空氣中,我們?cè)贔orce2Volume圖上觀測(cè)到了DNA分子的反差,由于很難判別針尖與樣品的初始接觸點(diǎn)而不能定量地計(jì)算它的形變。
(3)傳統(tǒng)的TM2AFM需要較大的traceforce(～110nN)才能穩(wěn)定成像,此時(shí)已經(jīng)把生物分子壓得很扁。
(4)利用Jumpmode方法可以很好地控制針尖與樣品間的作用力(～50pN),但必須采用軟針尖,此時(shí)熱擾動(dòng)會(huì)引起大約110nm的針尖振幅波動(dòng),因此很難精確地得到DNA分子的徑向形變。目前單分子壓彈性測(cè)量的各種方法還有其各自的局限性,與其他傳統(tǒng)的測(cè)試方法相比還不夠成熟。盡管如此,我們依然欣喜地看到許多物理學(xué)家、化學(xué)家、生物學(xué)家及材料科學(xué)家都被吸引到這個(gè)新興領(lǐng)域,這勢(shì)必極大地推動(dòng)該領(lǐng)域的發(fā)展。目前人們正在不斷地完善各種基于原子力顯微鏡技術(shù)的單分子力學(xué)測(cè)量技術(shù),如把它與單分子熒光、單分子拉曼光譜結(jié)合起來就很可能給出更新更有說服力的結(jié)果。另外,在發(fā)展單分子實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí),正在努力發(fā)展各種新的理論模型,將實(shí)驗(yàn)與理論模擬相結(jié)合去揭示許多單分子實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象中的一些本質(zhì)規(guī)律。我們期待隨著單分子技術(shù)的不斷發(fā)展,實(shí)驗(yàn)精度的不斷提高,能夠早日提供小力區(qū)DNA分子的壓彈性模量,結(jié)合其拉彈性與扭彈性的數(shù)據(jù),可以給出DNA分子力學(xué)性質(zhì)的完整描述?？傊?單分子力學(xué)是蓬勃發(fā)展的新興的交叉領(lǐng)域,當(dāng)人們積累了大量的單分子力譜的信息后,對(duì)生命現(xiàn)象中一些基本過程就會(huì)有一個(gè)更深的認(rèn)識(shí);同時(shí)單個(gè)生物大分子作為天然的納米材料,深入了解其力學(xué)性質(zhì)對(duì)納米器件的設(shè)計(jì)與制造也有很重要的意義。