血小板黏附到受損的血管壁上,是止血與血栓形成中的重要過程。血管性血友病因子(VonWillebrandFactor,VWF)與血小板受體GPIbα間的相互作用,介導著血小板的附著黏附以及滾動黏附過程,在血小板初始黏附階段起著非常重要的作用。

VWF的活性與其分子大小有關(guān),分子量越大,其活性越強。血管性血友病因子水解蛋白酶ADAMTS13(Adisintegrinandmetalloproteasewithathrombospondintype1motifs13)通過酶切VWF-A2結(jié)構(gòu)域中心的Tyr1605-Met1606肽鍵,對VWF的大小進行調(diào)節(jié),從而調(diào)節(jié)VWF的活性。目前有研究表明ADAMTS13存在低親和力的閉合構(gòu)象和高親和力的打開構(gòu)象；ADAMTS13中的spacer結(jié)構(gòu)域中5個特定的位點發(fā)生突變(R568K/F592Y/R660K/Y661F/Y665F),稱之為功能增強型突變體(GOF),其酶切活性相較WT增加約2.5倍；此外,低pH可以增強ADAMTS13的活性,Ca~(2+),Mg~(2+),Zn~(2+)等二價金屬離子亦可調(diào)節(jié)ADAMTS13酶切VWF-A2的活性。ADAMTS13在上述各種條件下的酶切活性的變化是否是與其自身的構(gòu)象發(fā)生變化有關(guān)?ADAMTS13分子是否存在多種構(gòu)象,低pH是否誘導ADAMTS13構(gòu)象發(fā)生改變,以及二價金屬離子是否會影響ADAMTS13構(gòu)象?

本研究利用原子力顯微鏡AFM分別對不同條件下WT-ADAMTS13及GOF-ADAMTS13進行形態(tài)學掃描。數(shù)據(jù)顯示,不同條件下,WT-ADAMTS13和GOF-ADAMTS13的體積(Volume)、投影面積(ProjectedArea)、最長徑(Maximumlength)相比,區(qū)別并不明顯。但是,WT-ADAMTS13蛋白顆粒的縱橫比值(AspectRatio)顯著性地小于GOF-ADAMTS13的縱橫比。對縱橫比數(shù)據(jù)進行柱狀圖分布并進行高斯函數(shù)擬合,WT-ADAMTS13的縱橫比呈雙峰分布,GOF-ADAMTS13的縱橫比呈三峰分布。我們將每個峰定義為不同的類型(stateI,stateII,stateIII),我們提出stateI是“封閉”的構(gòu)象,stateIII是“開放”的構(gòu)象,stateII是中間態(tài)構(gòu)象。數(shù)據(jù)顯示,在pH6和pH7.5條件下,WT-ADAMTS13采用兩種不同的構(gòu)象狀態(tài)(stateI,stateII),而在GOF-ADAMTS13中觀察到另外一種狀態(tài)(stateIII)。與pH7.5相比,WT-ADAMTS13的stateII和GOF-ADAMTS13的stateIII的百分比在pH6增加,WT-ADAMTS13的stateI和GOF-ADAMTS13的stateI和stateII降低,表明低pH可以誘導ADAMTS13呈現(xiàn)更加開放的構(gòu)象。當用EDTA螯合金屬離子后,ADAMTS13stateII和stateIII兩種構(gòu)象分布明顯增加,而對GOF的構(gòu)象分布影響不大。當再次加入不同的二價離子,我們發(fā)現(xiàn),加Ca~(2+),Mg~(2+)后,WT-ADAMTS13的stateI明顯增加,構(gòu)象變得更為緊湊；GOF在加入Mg~(2+)后,stateI亦明顯增加,說明Ca~(2+),Mg~(2+)可以穩(wěn)定ADAMTS13的構(gòu)象；Zn~(2+)對兩種蛋白的構(gòu)象均無影響,說明Zn~(2+)并不是通過影響ADAMTS13的構(gòu)象而使其活性發(fā)生變化。

本研究通過對不同條件下ADAMTS13的構(gòu)象數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,歸納提出ADAMTS13存在3種構(gòu)象狀態(tài),更加清晰的闡明了ADAMTS13在不同條件下發(fā)揮酶切活性時存在的多種構(gòu)象,且ADAMTS13的構(gòu)象受二價金屬離子調(diào)控,這些發(fā)現(xiàn)進一步加深了我們對ADAMTS13水解VWF,調(diào)控其活性的理解,同時為ADAMTS13相關(guān)血栓疾病的理解及抗血栓藥物的研發(fā)提供指導意義。
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